Ahoj, me by docela vyhovoval pristi vikend. Co s agarozou? odhaduju ze ji tam mame tak na 2-4 gely, vic asi ne. Bude nam to stacit nebo mam zkusit nekde sehnat? M
On 12/04/2014 10:08 PM, Radka Haneckova wrote:
Ahojte,
presouvam diskusi o nasem projektu na biolab mailing list. Mam taky update: protoze elektroforeza nam vicemene chodi, a transiluminator taky, chtela bych prikrocit k dalsimu kroku - testrun openPCR. Minule jsme termocykler pousteli naprazdno a jel. Chtela bych ted otestovat zda a) je schopen uspesne udelat PCR a b) ten mastermix z openbiotechu je funkcni. Za tymto ucelem je vhodne sjet PCR z nejakeho dobre definovaneho templatu s primerama ktere jsou overene funknci. Mam z prace zbyle hodne naredene pTracer plazmidy https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/V88520 a par primeru ktere jsem pred lety navrhla amplifikujici GFP+BSD kazetu z toho plazmidu. Delaji produkt kolem 1800 bp a vzdycky mi jeli bez problemu. Myslim ze to je idealni na testovani. Tak az se domluvime na termine, muzem to zkusit sjet. Materialy donesu, mapy, protokol a sekvence dam na KpnI.
chido
---------- Forwarded message ---------- From: *Radek Pilar* <mrkva@mrkva.eu mailto:mrkva@mrkva.eu> Date: 2014-11-26 1:11 GMT+01:00 Subject: Elektroforeza info To: Radka Haneckova <chidori@emptytriangle.com mailto:chidori@emptytriangle.com>, Jiří Dluhoš <jiri.bluebear.dluhos@gmail.com mailto:jiri.bluebear.dluhos@gmail.com>, Blandria Almighty <blandrium@gmail.com mailto:blandrium@gmail.com>
Ahojte, posilam mensi rekapitulaci pokusu s elektroforezou - zvlast pro Blanku, nevim jestli jsi nejake info od soboty dostala. Jestli jo, omlouvam se za zbytecnou redundanci informaci.
Kazdopadne, v sobotu jsme zkouseli elektroforezu s tou barvickou co nam zbyla z rijnove session a nevyslo to vubec. Zkusili jsme z koncentratu namichat novy sybr a gel znovu obarvit ale to uz se nepovedlo. Zbytek barvicky jsme ulozili do nedele.
V nedeli jsme s chido zkusili jeste jeden gel a pouzili sobotni roztok sybru v TAE. Opet prakticky neuspesne (byl videt kousek jednoho prouzku, jinak nic). Potom jsem jeste zkusil do zbytku vzorku DNA pridat:
- 50ul TAE + 1ul sybr - svitil
- 50ul TAE + 1ul EtBr - svitil pomerne jasne, viditelny i bez filtru
- 150uL TAE + sybr (to cim jsme se pokouseli barvit gel) - nesvitil vubec
Nasledne jsem zkusil gel doobarvit v roztoku EtBr (0.5ug/ml), ani po hodine a pul se nic nezmenilo.
Behem pondelka jsme konecne prisli na to ze v manualu k barvice je jen jakoby mimochodem zmineno ze sklo je nejhorsi material ve kterem se to da skladovat.
Dneska jsem zkusil jeste jeden gel, rozriznul na pulku, jednu vrazil do cerstve namichaneho sybru - bohuzel asi jen 20ml a jeste k tomu lehce slabsi nez ma byt (mohlo tam byt tak 1.5-2ul) - tech 500ul se mi rozmrazovat nechtelo. Druha pulka sla do nedelniho roztoku EtBr.
Vysledky nebyly zadna hitparada EtBr se nechytal vubec, vzhledem k tomu ze v nedeli mimo gel fungoval naprosto netusim proc to tentokrat neproslo - mozna malo DNA ve vzorku?
Sybr byl videt docela dobre i bez filtru ale tak jasne jako kdyz jsme to zkouseli s sachyho laserem to nesvitilo (laser mel skoro vybite baterky takze svitil zhruba stejne jako LEDky a i sybr fluoreskoval zhruba srovnatelne). Fotku bohuzel nemam, nedarilo se mi zaostrit.
Co se filtru tyka, folie chodila o dost lepe nez ten filtr z infrapajky co jsme pouzivali minule, idealni mi prisly 2 vrstvy pres sebe.
Kazdopadne, stav je takovy ze: a) nechodi nam EtBr, netusim proc. Mozna kdyby se pridala barvicka rovnou do gelu by to fungovalo lip. b) vysledky z barveni Sybrem taky nejsou takove jake bych cekal c) co se mnozstvi gelu tyka, zkousel jsem 20ml a to uz bylo docela na hrane co se tyka pouzitelnosti, 30ml bude podle me optimum. d) sybr *vazne* nema rad sklo, vypada to ze 24h ve sklenene lahvicce v lednicce stacily na kompletni likvidaci e) vanicka na elektroforezu porad tece a nemuzu prijit na to kudy...
Ad b) - tady bych cekal ze to muze zpusobene trosku nizsi koncentraci nez je doporuceno. Druha moznost je male mnozstvi DNA ve vzorku (to by rozumne vysvetlovalo i a) )... Kdo vi, mame asi jeste co zkouset.
Ad e) ted me napadlo ze nejjednodussi bude ji ponorit do umyvadla plnem vody dnem vzhuru, ach jo.
Do pristi akce zkusim nekde vyhrabat svuj stary kompakt Canon ktery by mel umet i rucni nastavovani parametru expozice a fotit do RAWu, pokud se osvedci klidne ho v labu pro tohle pouziti necham.
Mrkva
-- http://chidori.or.cz "I was twenty-five and too old to be unusual." James Watson, The Double Helix
Biolab mailing list Biolab@brmlab.cz https://brmlab.cz/cgi-bin/mailman/listinfo/biolab